X
تبلیغات
physiology of animal Iran - تهیه بافر نمونه الکترو فورز پروتئین

physiology of animal Iran

فیزیولوژی دام

تهیه بافر نمونه الکترو فورز پروتئین

ü   تهیه بافر نمونه الکترو فورز پروتئین :

 

(Mix A) : 6.5 Sample Buffer

Tris-cl 0.5 M ( PH:6.8)                     1.2 cc

SDS (10%)                                          2cc

Gysrol                                                  1cc

                                      cc  0.5                        (0.5%)      برم فنل بلو      

                   4.8 cc                                  آب مقطر

(Mix B) :

اضافه کردن مرکاپتو اتانول به میزان 12% حجم در موقع مصرف

                                        ↓

اضافه نمودن به میزان 5/1 تا 6/1 حجم از سوسپانسیون باکتری

                                       ↓

(یک سی سی از سوسپانسیون باکتری + 0.2 سی سی از Mix B   )

                                      ↓

قرار دادن در آب جوش به مدت 3-2 دقیقه

                                    ↓

انتقال به فریزر در حجم کم (200 میکرو لیتر )

 

(1 سی سی Mix A  = 120میکرولیتر مرکاپتو اتانول + 880 سی سی Mix A  )

 

 

 

 

Ø   الکتروفورز پروتئین ( محلول های پایه ):

اکریل آمید  + بیس اکریل آمید :

اکریل آمید                      29.2 گرم

بیس اکریل آمید               0.8 گرم

آب مقطر                   تا 100 سی سی

*عبور از فیلتر 0.45 میکرون و نگه داری در یخچال در ظرف تیره

 

Ø   بافر تریس 1.5 مولار   (PH:8.8)  (جهت ژل پایینی ،ژل جدا کننده )

 تریس                18.2 گرم

آب مقطر             80 سی سی

PH = 8.8     با HCL   

حجم نهایی به 100 سی سی با آب مقطر 

+ 0.4 گرم SDS  ( از محلول 10% )

 

Ø         بافر تریس 0.5 مولار (PH = 6.8  ) ( برای ژل بالایی ، ژل متراکم کننده )

تریس             6.1 گرم

آب مقطر    80 سی سی

PH با HCL  (1N) به 6.8 برسد .

حجم نهایی با آب مقطر به 100 سی سی برسد + 0.4 گرم SDS ( از محلول 10 % )

 

Ø بافر الکترود 5X :

 

 

تریس                15 گرم

گلایسین            75 گرم      PH = 8.3

SDS                   5 گرم

آب مقطر       1000 سی سی

 

 

Ø بافر الکترود 1X :

 

تریس                    3 گرم

گلایسین           14.4 گرم

SDS                     1 گرم

آب مقطر            1000 سی سی

 

 

 

 

ü   

ü  محلول رنگ آمیزی :

5 متانول + 5 آب مقطر + 1 اسید استیک + 0.1 % رنگ کومازی بلو

 

ü  محلول رنگ بری :

1 متانول + 5 آب مقطر + 5 اسید استیک

 

ü  محلول ادامه رنگ بری و نگهداری :

7 % استیک اسید در آب مقطر

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ø    

Ø   ژل پایین  :

        :  SEPARATING GEL            10%                       12%

                                                           ↓                           ↓

(30:1) اکریل آمید + بیس اکریل آمید←         5 ml                                6 ml

بافر تریس 4 x (1.5M  ، PH = 8.8 )    ←           3.75                              3.75

آب مقطر                                         ←            6.25                             5.25

آمونیوم پر سولفات (10% )                ←            l 50 μ                       l 50 μ

(تمد) TEMED                                 ←             10 μ l                           10μl

                                                                        ↓                                    ↓

                                                                15.06 ml                        15.06 ml

 

 

Ø   ژل بالایی :

STACKING GEL:                                  6 %               4 %

                                                                  ↓                   ↓

(30:1) اکریل آمید + بیس اکریل آمید      ←              1 ml                   0.65 ml

بافر تریس 4 x (0.5M  ، PH = 6.8 )         ←                1.25                      1.25          

 آب مقطر                                             ←               2.65                       2.65

آمونیوم پر سولفات(10% )                                   l μ 25                      l μ 25

(تمد) TEMED                                       ←          5 μ l                        5 μ l         

                                                                          ↓                            ↓

                                                                                                             4.98

 

توجه:بافر تریس در هر دو ژل با اضافه نمودن SDS  (10%) باید به حجم ذکر شده برسد .

·        غلظت نهایی SDS  باید 0.4 % باشد .

ü  جداسازی پلازمید از باکتری :

1-     کشت دادن سلول باکتری در محیط کشت مناسب برای یک شب .

2-    سانتریفیوژ کردن نمونه ها در 14000 دور برای 1.5 دقیقه .

3- محلول رویی دور ریخته شود و رسوب در 200μl محلول A (سرد شده ) حل گردد.

*Solution A : 50 mμ glucose , 25mμ Tris-cl(PH=8) ,10mμ EDTA(PH=8)

4-  200μl محلول B اضافه شده و با وارونه کردن هم زده شود.

*Sol B : 1ml NAOH(0.4M) , 1ml SDS (2%)

(به صورت تازه استفاده شود .)

200μl محلول C  (سرد شده) اضاف گردد .

*Sol C :1.15 ml Acetic acid , 2.85 Distilled water , 6 ml Potassium acetate (5M)(PH=4.8)

5-  لوله ها به مدت 5 دقیقه در 14000 دور سانتریفیوژ گردند .

7-  محلول رویی به میکروتیوب تمیز منتقل و برای یک دقیقه سانتریفیوژ گردد.

8- محلول رویی به لوله جدید منتقل و 2 حجم اتانول خالص (-20°C) اضافه گردد.

9-   محلول برای حداقل 15 دقیقه بر روی یخ نگه داری شود.

10-               سانتریفیوژ نمودن برای 15 دقیقه در 14000 دور .

11-                دور ریختن اتانول و شستن توسط 1 میلی لیتر اتانول 70% .

12-              سانتریفیوژ نمودن به مدت 5 دقیقه .

13-           دور ریختن اتانول و خشک نمودن نمونه در 37°C برای چند دقیقه.

14-            حل نمودن DNA در 50ml بافر TE حاوی RNase .

TE : 1mM Tris-cl (PH=7.5) , EDTA (0.01M) (PH=8) , RNase (final conc. 20μg/ml)                        

 

 

 

ü     نحوه تهیه بافر  TE :

Tris-cl 10Mm (PH=7.5)  ,  EDTA 1 Mm (PH=8) **

Make from →  1 m stock of Tris-cl (PH=7.5)  ,

                        0.5 stock of EDTA (PH=8)

 

EDTA 0.5M (PH=8) →    93.05 g  EDTA  ,

                                             350 ml distilled water

-        تنظیم PH به 8 با اضافه نمودن  NAOH .

-        رساندن حجم نهایی به 500 میلی لیتر و اتوکلاو نمودن.

 

Tris-cl 1M (PH=7.5)  →   60.57 g Tris-cl 

                                             350 ml distilled water

-        تنظیم PH  به 7.5 با اضافه نمودن HCL .

-        رساندن حجم نهایی به 500 میلی لیتر و اتوکلاو نمودن .

TE Buffer → 1 ml stock Tris-cl (1M ) ,

                       200μl stock EDTA (0.5M) ,

                       distilled water 100 ml .

و اتوکلاو نمودن.

 

 

 

 

ü     جداسازی DNA کروموزومی از باکتری :

1-     سلول باکتری در 5 میلی لیتر محیط کشت داده شود .

2-    1.5 میلی لیتر از سوسپانسیون به میکروتیوب منتقل و توسط سانتریفیوژ کردن در 1.5 دقیقه و 3000 دور رسوب داده شود .

3- رسوب به مدت 30 دقیقه در فریزر نگه داری گردد .

4-  رسوب در 200μl بافر TE حل شده و پس از اضافه نمودن 8μl لیزوزیم (10μg/ml) به مدت 30 دقیقه در 37°C نگه داری شود .

5-  40μl از سدیم پر کلرات (4M) ، 24μl SDS (10%) ، 8μl پروتئیناز- ک g/ml) μ(20                    به محلول اضافه و بعد از همزدن توسط وارونه کردن به مدت 2 ساعت در 45°C نگهداری شود .

6-  2 حجم اتانول 100%) نگه داری شده در فریزر( اضافه و به مدت 30 دقیقه یا بیشتر در فریزر نگه داری شود .

7- به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردد (13000 دور در دقیقه ، 4°C )

8- اتانول دور ریخته شود و رسوب حاصله توسط اضافه نمودن  1ml اتانول 70 % شسته شود .

9-   چند ثانیه رسوب در محیط معمولی اتاق نگه داری شود تا خشک گردد .

10- در 500μl بافر TE حل گردد .

11-  DNA بدست آمده با حجم مساوی ترکیب فنل : کلروفرم : ایزوآمیل الکل (1:24:25) مخلوط شده و در درجه حرارت معمولی اتاق به صورت وارونه کردن هم زده شود تا کاملا یکنواخت گردد.

12- به مدت 3 دقیقه در 5000 دور سانتریفیوژ گردد تا سه فاز مجزا تشکیل شود .اگر سه فاز تشکیل نشد ، مجددا سانترفیوژ تکرار گردد .

13-                      فاز رویی به میکروتیوب تمیز و استریل منتقل و مرحله قبل سه بار تکرار گردد.

14-                       هر بار محلول رویی به میکروتیوب تمیز و استریل منتقل گردد .

15-                       محلول رویی یک بار نیز با اضافه نمودن کلروفرم : ایزوآمیل الکل (1:24) عصاره گیری شود .

16-                       محلول رویی به میکروتیوب تمیز منتقل و DNA با اضافه نمودن 2 حجم اتانول (100%) و 0.1 حجم محلول سدیم استات 3M (PH=4.8) ونگه داری در فریزر به مدت یک شب رسوب داده شود .

17-                      ترکیب به مدت 5 دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ شده و رسوب توسط اتانول 70% شسته شود .

18-                      پس از خشک شدن در 50μl بافر TE {حاوی RNase (10mg/ml) به غلظت نهایی 20μg/ml}حل شود .

 

 

 

 

 

 

+ نوشته شده در  جمعه 1389/11/22ساعت 12:31 بعد از ظهر  توسط محمد حسن افشاری  |